Fællesmøde mellem Dansk Selskab for Flowcytometri og Dansk Selskab for Klinisk Biokemi

 

      Emne:                 Flowcytometri.

      Tid:                     Fredag d. 10. november 2000, 14:15 – ca. 17:00

      Sted:                   Frederiksberg Hospital, auditoriet.

      Mødearrangør:     Erik Kjærsgaard (DSFCM) og Steen Sørensen (DSKB)

 

Program                    

                                 Velkomst v. formanden for DSKB Steen Sørensen

Kl. 14:15 - 14:40        Flowcytometri i sundhedsvidenskabens tjeneste v .Carl-Henrik Brogren.

Kl. 14:40 - 15:00        Leukæmidiagnostik ved flowcytometri v. Christian Geisler

Kl. 15:00 - 15:15        CD4/CD8 bestemmelse v. Keld Homburg.

Kl. 15:15 - 15:30        Den danske kvalitetskontrol af flowcytometrianalysen for CD3, CD4 og CD8 v. Erik Kjærsgaard.

Kl. 15:30 - 15:50        Pause

Kl. 15:50 - 16:10        Clinical validation of a hematopoietic stem cell quality programme of autografts supporting high dose therapy in multiple myeloma: A report from Nordic Myeloma Study Group v. Hans Johnsen.

Kl. 16:10 - 16:30        DNA og celledeling målt ved flowcytometri v. Jørgen K. Larsen.

Kl. 16:30 - 16:45        Flow-sorting of single cells to genetic analysis v. Thomas Rasmussen.

Kl. 16:45 - 17:00        Flowcytometri af urin v. Erik Vittinghus.

 

Abstracts

 

Velkomst

Steen Sørensen

Flowcytometriske målemetoder har igennem snart mange år være anvendt til antalstælling af erythrocytter, leucocytter, thrombocytter, og på det seneste også af reticulocytter, i klinisk biokemiske afdelinger. Men flowcytometri kan også anvendes til at identificere vigtige funktionelle molekyler på såvel celleoverfladen som intracellulært ved hjælp af fluorescens mærkede antistoffer med næsten utrolige kliniske applikationsmuligheder.

Med dette møde ønsker bestyrelsen at tiltrække medlemmernes interessere for dette hastigt voksende område, og i samarbejde med Dansk Selskab for Flowcytometri har vi tilrettelagt dette møde. Der vil blive en generel gennemgang af selve metoden efterfulgt af indlæg om immunologisk fænotyping af celler til at adskille forskellige former for leukæmi og til at vurdere cellulær immundefekter og autologe stamcellegrafter. Også områder som kvalitetskontrol af lymfocytsubpopulationer (CD4 og CD8), flowcytometrisk sortering med henblik på gendiagnostik samt undersøgelse for DNA-ploidi vil blive dækket. Endelig vil der være et indlæg om de foreløbige erfaringer med flowcytometrisk undersøgelse af urinen til erstatning af urinmikroskopi.

 

Flowcytometri i sundhedsvidenskabens tjeneste.

Carl-Henrik Brogren, Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi, Afdelingen for Mikrobiologi. E-mail. chb@fdir.dk

Cellernes ydre og indre struktur karakteriseres med bl.a. antistoffer rettet med de antigene strukturer, der er specifikke ved hver enkelt celle population. Hvis antistoffer konjugeres med forskellige specifikke fluorokromer, vil hver celletype entydigt kunne mærkes med en serie af fluorescerende stoffer. Belyses disse fluorokromer med lys fra laser eller lampe vil fluorescerende lys af forskellige bølgelænge udsendes. Forskellige typer af optiske filtre kan adskille lyset og sende det til forskellige detektorer (PMT’er). Princippet i flowcytometri er således ganske enkelt. Ved at sende cellerne enkeltvis, adskilt i en vandstråle, forbi en laser, og opfange fluorescenssignalet fra hver enkelt celle, opnår man, at man kan tælle antallet af celler, samt specifikt karakterisere hver celle på antigenniveau. Ud over de flourescerende signaler er alle instrumenter også udstyret med lysspredningsdetektorer, der bruges ved karakteriseringen af partiklernes størrelse og struktur.

Flowcytometre findes i mange forskellige fabrikater og udgaver, med op til i alt 6 detektorer (2 scatter og 4 fluorescens PMT detektorer). Lyskilden kan variere fra almindelige lamper (Hg-lampe) til lasere af forskellig bølgelængde og styrke. Ikke desto mindre er apparaterne opbygget på næsten samme måde.

Der findes et virvar af firmaer, som sælger fluorescens mærkede antistoffer og andre reagenser til flowcytometri. Udvalget er størst til studier af humane og murine celler, men en lang række andre dyrearter kan også studeres. Endvidere er det ikke vanskeligt selv at foretage en fluorokrom mærkning af et oprenset antistof, rettet mod netop det antigen man er interesseret i at påvise. Enklere er det at biotinylere antistoffet, og anvende avidin konjugerede fluorokromer som sekundære reagenser.

Det er også muligt at foretage en indirekte mærkning gennem et artspecifikt sekundært antistof konjugeret med fluorokrom. Inden for de senere år er teknikker udviklet til at mærke antigener også intracellulært, ved brug af permeabiliseringsreagenser.

Det er vigtigt at huske, at flowcytometri er en teknik for alle typer af partikler fra større parasitter, alger og lignende, til mindre bakterier, kromosomer og sågar enkelte makromolekyler, f.eks. DNA.

På Los Alamos National Laboratory, USA reference center for flowcytometri, arbejdes med flowcytometri, der kan detektere helt ned til DNA fragmenter på 200 bp mærket med DNA bindende fluorescerende stoffer, hvis fluorescens er proportional med molekylernes størrelse. Flowcytometri kan således anvendes inden for en lang række fagområder. De mest kendte anvendelser er inden for immunologien til klassificering af leukocytter i blod, men en række cellebiologiske og mikrobiologiske applikationer findes også vidt udbredt. Teknikken er under fortsat udvikling gennem udvikling af nye lasertyper, nye flourescerende stoffer, samt detektorer (photon counter), der kan opfange meget små lysmængder.

De molekylære applikationer omfatter også mærkning af mindre molekyler med antistoffer og receptorer koblet til en partikel, der således bruges til kvantitativ bestemmelse af de mindre molekyler.

Den flowcytometriske teknik – en automatisk form for tælling af partikler, celler og molekyler – har derfor udbredte anvendelsesmuligheder inden for stort set alle discipliner.

Link med utallige oplysninger om flowcytometri findes på www.flowcytometri.dk.

Flere internet diskussionsgrupper om flowcytometri findes også.

 

CD4/CD8 bestemmelse.

Keld Homburg, Vævstypelaboratoriet, Rigshospitalet

CD4/CD8 bestemmelse med flowcytometri er den hyppigst foretagne analyse for cellulær immundefekt. HIV-positive patienter får rutinemæssigt foretaget en bestemmelse hver 3-6 måned.

Antalskoncentrationen af CD4+ lymfocytter er en indirekte markør for viralt load og er bestemmende for instituering af profylakse mod opportunistiske infektioner. Sammen med måling af plasma HIV RNA er antallet af CD4+ lymfocytter en monitor for effektiviteten af antiviral kombinationsbehandling. CD4 molekylet er coreceptor i den MHC klasse II-restriktede antigen inducerende T-celle aktivering og præsenteres overvejende af T-hjælperceller. CD8 molekylet præsenteres af MHC klasse I-restriktede cytotoksiske T-celler. CD4 fungerer som receptor for HIV. Under primær HIV infektion ses en øget fraktion af CD4+ lymfocytter, dvs. høj CD4/CD8 ratio. Ratioen inverteres under senforløbet af infektionen, som følge af den HIV udløste destruktion af CD4+ celler og den kompensatoriske øgning af CD8+ lymfocytter. Trods kombinationsbehandling ses ratio uændret, selvom antalskoncentrationen af CD4+ celler øges.

 

Den danske kvalitetskontrol af flowcytometrianalysen for CD3, CD4 og CD8.

Erik Kjærsgaard, Hæmatologisk Laboratorium, Amtssygehuset i Herlev.

I 1998 nedsatte Dansk Selskab for Flowcytometri et udvalg til at tage sig af koordineringen af en kvalitetskontrol af flowcytometriske analyser.

Udvalget besluttede at starte med en undersøgelse af T-celle analyserne CD3, CD4 og CD8 i EDTA-blod, og bestemte, at prøvematerialet skulle sendes med kurerpost således, at det var modtageren i hænde senest 36 timer efter blodprøvetagningen.

Alle, der udfører flowcytometriske analyser, kan deltage i kontroludsendelserne, men man skal acceptere følgende punkter:

1.                Udsendelsen af prøver skal gå på omgang mellem de deltagende laboratorier.

2.                Afsenderen medsender svarskema med tappedato og tid.

3.                Prøverne skal sendes med kurerpost således, at de er klar til analyse hos modtageren indenfor 36 timer efter tapning.

4.                Afsenderlaboratoriet betaler forsendelsesomkostningerne.

5.                Der skal ske 1 udsendelse om måneden.

Indtil nu er der i alt foretaget 19 prøveudsendelser, 8 i 1998, 7 i 1999 og 4 i 2000, og der har deltaget fra 8 til 10 laboratorier i kvalitetskontrollen.

Middelværdien af CV% for de 19 udsendelser har været 12% for såvel CD3, CD4 og CD8. Denne procent er højere end man finder intralaboratorielt, hvor CV% er 2%-3%, når analysen udføres af samme laborant og på samme flowcytometer, men vurderet i forhold til den biologiske variation, der for de 3 analyser er på ca 40%, er den opnåede interlaboratorielle variation fuldt tilfredsstillende.

Forsendelsestiden har i det store og hele kunnet holdes inden for de vedtagne 36 timer. Af de ialt 150 forsendelser har der i 11 tilfælde været forsendelsestider ud over de 36 timer. I ingen af disse tilfælde er der fundet en CV%, der er større end ved de øvrige prøveudsendelser.

De deltagende 10 laboratorier har udvist en høj grad af compliance i perioden, og har udsendt prøver og resultater inden for de fastsatte terminer. Det er forbavsende, at 10 laboratorier kan opnå så ensartede resultater, når man tænker på, at der ikke er andre krav til den anvendte metode end at den udføres på et flowcytometer.

 

Clinical validation of a hematopoietic stem cell quality programme of autografts supporting high dose therapy in multiple myeloma: A report from Nordic Myeloma Study Group.

Hans E. Johnsen, Medicinsk hæmatologisk afdeling, Amtssygehuset i Herlev

Optimal quality assessment of haematopoietic autografts has become a common demand in adjuvant therapy supported by stem cell reinfusion in multiple myeloma. The objectives of this study were to validate a flow cytometry dependent quality assessment programme for autografts and evaluate new potential analytic improvements on leukapheresis products transplanted in 203 newly diagnosed patients from 14 participating centres in the Nordic area.

The supportive reinfusion of autologous stem cell grafts qualified by CD34+ cells enumeration was evaluated by probability of obtaining clinical objectives as efficacy, toxicity and safety. The end points were days of hospitalisation, transfusion of blood components from day of transplantation, time dependent grading of haematological toxicity and finally, regime related death or disease progression. It is concluded that a graft with a stable acceptable probability of clinical outcome contains more than 5 x 106 CD34+ cells/kg bodyweight. Below this number there is an increasing risk (> 10% increment) for unacceptable time in hospital, transfusions, haematological toxicity and disease recurrence. Finally, there seems to be strong indications that subset analysis of lineage specific haematopoietic progenitors as well as tumour cell quantitation by flow cytometry of myeloma markers as well as real time quantitation of CD34 mRNA does not improve quality assessment solely based on flow cytometry dependent enumerating of CD34+ cells.

 

DNA og celledeling målt ved flowcytometri

Jørgen K. Larsen. Finsenlaboratoriet, Finsencentret, Rigshopitalet, Afsnit 8621, Strandboulevarden 49, 2100 København Ø. E-mail j.k.larsen@finsenlab.dk

Ved flowcytometrisk måling af nukleært DNA kan man ikke blot analysere cellernes fordeling imellem cellecyklusfaserne G0/G1, S og G2/M, men også fordelingen mht. DNA-ploidi (1). Påvisning og kvantificering af DNA-aneuploide subkloner har betydning i kræftforskningen. Vævsbiopsier skal præpareres til suspensioner af enkelte celler eller kerner før måling (1). Til farvning af DNA er en række fluorokromer til rådighed, hvoraf DAPI og Hoechst 33342 exciteres med ultraviolet lys, propidiumjodid, 7-amino-aktinomycin-D og PicoGreen med 488 nm, og To-Pro-3 med 633 nm (2). Imidlertid giver en DNA-måling i sig selv ikke direkte cellekinetiske oplysninger, dvs. om cellernes trafik inden for cellecyklus eller ind i eller ud af cellecyklus. Hertil kræves tidsstudier og tilføjelse af supplerende markører. Flowcytometriske paralleller til de klassiske cellekinetiske metoder er baseret på hhv. mærkning af DNA-syntetiserende (S-fase) celler med bromodeoxyuridin (BrdU) in vivo eller vitro efterfulgt af immunfluorescens farvning af indbygget BrdU (3), og mitose-blokade efterfulgt af flowcytometrisk måling af fraktionen af mitotiske celler (4). Uden brug af mærkning in vivo eller vitro er diskrimination mellem celler i og uden for cellecyklus til en vis grad mulig ved immunfluorecens farvning af proliferationsassocierede antigener som Ki-67 og PCNA (5). En helt anden flowcytometrisk metode til måling af celledelinger er baseret på in vitro mærkning med carboxyfluorescein-diacetate-succinimidyl-ester, idet cellens indhold af denne stabile markør halveres ved hver celledeling. Denne metode kan ligesom BrdU-metoden (3,5) kombineres med immunfluorescens farvning af celleoverflade- eller intracellulære antigener (6).

Ref.: (1) Vindeløv LL & Christensen IJ (1990) Cytometry 11:753. (2) Molecular Probes, www.probes.com. (3) Dolbeare F (1995) Histochem J 27:339, 27:923; (1996) Histochem J 28:531. (4) Juan G et al. (in press) Cytometry, 3rd ed. Methods in Cell Biology 63, kapitel 15. (5) Larsen JK (2000) In: Flow cytometry, 3rd ed.; M Ormerod (ed), Oxford University Press, p 133. (6) Lyons AB (1999) Immunol Cell Biol 77:509. - Se endvidere metodebeskrivelser i Current Protocols in Cytometry (John Wiley & Sons, New York; opdateres hvert kvartal).

 

Flow-sorting of single cells to genetic analysis

Thomas Rasmussen, Hæmatologisk afd. Amtssygehuset i Herlev.

We have developed a panel of RT-PCR assays working on single flow-sorted cells. The basic idea behind the development of this method was to combine two powerful methods, flow cytometry and PCR. Flow cytometry characterize the cell by its size, granulation, and the presence of up to four cluster of differentiation (CD) antigens, thus being able to identify genetic alterations in cells at specific stages of differentiation. By using RT-PCR on single flow-sorted cells in combination with Poisson statistics, quantitation of cells expressing a specific mRNA in a phenotypically defined population is possible. This method can be easily applied to determine the phenotype of malignant cells and to characterize rare cell types.